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RIP实验流程介绍
发布时间:2022-03-29 点击次数:197次
  RIP技术主要是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来,经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行q-PCR验证或者测序分析。RIP是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术,是了解转录后调控网络动态过程的有力工具,可以帮助橙子视频最新网址发现miRNA的调节靶点。根据需求,金开瑞可以提供RNA/蛋白、RNA/RNA互作验证RIP技术服务。
 
  应用:
 
  1.用抗体或表位标记物捕获细胞核内或细胞质中内源性的RNA结合蛋白;
 
  2.防止非特异性的RNA的结合;
 
  3.免疫沉淀把RNA结合蛋白及其结合的RNA一起分离出来;
 
  4.结合的RNA序列通过定量RT-PCR或高通量测序(RIP-Seq)方法来鉴定。
 
  RIP实验流程:
 
  (一)细胞裂解液获取
 
  A.单层细胞或者贴壁细胞处理
 
  1.冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次
 
  2.加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来,收集至enpendoff管
 
  3.1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞
 
  4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后于冰上静置5min
 
  5.每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80℃
 
  B.悬浮细胞处理:先收集细胞再计数,然后清洗裂解
 
  C.组织样品处理
 
  1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次
 
  2.加入冷PBS后,用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞,计数
 
  3.1500rpm,4℃离心5min,弃上清,收集细胞
 
  4.用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞,吹打均匀后置于冰上静置5min
 
  5.每管分装200ul细胞裂解液,贮存于-80℃
 
  (二)磁珠的准备
 
  A.实验前准备
 
  1、enpendoff管
 
  2、磁力架
 
  3、冰盒,RIPWashBuffer置于冰上
 
  4、抗体,置于冰上
 
  5、涡旋震荡器
 
  6、枪、枪头放于超净台照射30min,枪喷DEPC水
 
  B.磁珠准备过程
 
  1.重悬磁珠
 
  2.标记实验所需的enpendoff管,样品包括目的样品,阴性对照与阳性对照
 
  3.吸取50ul重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管
 
  4.每管加入500ulRIPWashBuffer,涡旋震荡
 
  5.将enpendoff管置于磁力架上,并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线,去上清,重复一次
 
  6.用100ul的RIPWashBuffer重悬磁珠,加入约5ug相应抗体于每个样品中
 
  7.室温孵育30min
 
  8.将enpendoff管置于磁力架上,弃上清
 
  9.加入500ulRIPWashBuffer,涡旋震荡后弃上清,重复一次
 
  10.加入500ulRIPWashBuffer,涡旋震荡后置于冰上

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